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本研究对4个队列、采用不同的方法来评估AD患者的适应性免疫（图1a）。首先，采用质谱流式细胞技术研究AD患者和轻微认知障碍患者（mild cognitive impairment，MCI）（队列1）的PBMC（图1a），随后，采用免疫细胞标志检测和聚类算法SPADE分析，发现MCI或AD样本的CD8⁺细胞群数目增加（图1b，即cluster 63）；基于各个样本的定量比较也表明CD8⁺细胞群在MCI或者AD中比对照（control）中高（图1c）。基于marker基因的表达确定该细胞群为CD3⁺CD8⁺CD27^- T效应记忆CD45RA⁺细胞（T_EMRA）（图1d），该细胞主要功能是分泌炎性因子和细胞毒性细胞因子；进一步，作者发现MCI和AD中CD8⁺ T_EMRA细胞和认知水平呈负相关（图1e）。为了鉴定AD或MCI的CD8⁺ T_EMRA细胞是否与正常人有别，研究者对PBMC予以phorbol 12-myristate 13-acetate（PMA）刺激，结果发现MCI/AD样本较control有更高的γ-干扰素（IFN-γ）水平（图1f）；随后，通过对7个control和6个MCI/AD样本的scRNA数据的差异分析，发现MCI/AD的CD8⁺T细胞的氨基酸代谢、TCR和细胞因子信号相关基因高表达（图1g，h）。

图1  AD/MCI样本的外周CD8⁺T细胞特征

采用免疫组织化学技术对AD和control的尸检组织（队列3）进行CD8和Aβ蛋白表达及CD8⁺细胞与脑血管组织的相对位置进行检测。结果在AD患者的大脑海马中存在大脑淀粉样血管病变（cerebral amyloid angiopathy，CAA）区域，且血管周隙含有大量的血管外CD8⁺T细胞（图2a）。同时，AD的海马组织中较control检出更高比例的CD3⁺CD8⁺T细胞（图2b）；此外，研究还发现，AD的海马组织中的CD8⁺ T 细胞与MAP2⁺神经元突起很可能存在相互作用（图2c），且AD患者的软脑膜的CD3⁺CD8⁺ T细胞与海马体空间临近（图3d）。

图2  AD患者的CD8+T细胞进入脑部

采用Plate-seq和Drop-seq两种测序方式，对健康样本、AD患者和帕金森疾病（Parkinson’s disease，PD）患者进行脑部的CD8⁺ T细胞扩张研究（图3a），首先，对5个健康人、3个AD样本和2个PD样本的脑脊液采用Plate-seq单细胞TCR测序，发现主要的克隆扩张为CD8⁺ T细胞，其中一个AD样本的CD8⁺扩增T细胞占比44%（图3b），基于marker基因鉴定该细胞群为CD8⁺CD45RA⁺CD27^- T_EMRA细胞（图3c），进一步，从脑脊液分选CD8⁺CD45RA⁺CD27^- T_EMRA细胞，采用Drop-seq RNA和TCR测序也证实了大部分脑脊液细胞是T细胞（图3d，e）；scTCR-seq表明CD8⁺ T细胞与克隆型T细胞高度重合（图3f），且AD/MCI样本的克隆扩张比control强（图3g），基于各样本最高丰度克隆型的比较亦证实了这种克隆差异（图3h）；基于高丰度TCR克隆型（TCRαβ>5）差异分析发现MCI/AD高表达细胞毒性效应基因（NKG7、GZMA、GZMH和GZMK）（图3l），对高丰度克隆型对应细胞类型数量统计发现49.13%为CD8⁺ T_EMRA细胞（图3j）；MCI/AD与control的CD8⁺ T_EMRA细胞差异分析发现MCI/AD高表达细胞毒性效应基因，如NKG7、GZMA（图3k）；尽管CD8⁺细胞进入脑部是否通过脑脊液仍然未知，但是在CD8⁺细胞定位到GZMA蛋白的表达（图3i），且AD患者的GZMA⁺CD8⁺的细胞比例远远高于对照样本（图3m）。

图3  AD患者的脑脊液呈现CD8⁺ T_EMRA细胞克隆扩张

采用非加权的网络分析各个组别内部或之间的TCRαβ共有克隆型，结果发现一个MCI样本和一个AD样本有共同的TCRαβ克隆型（图4a），另一个AD样本的TCRβ克隆型也与之一致（CDR3：CASSLGQAYEQYF）（图4b），该克隆型已知为EBNA3A（一种疱疹病毒）的特异性克隆型。对这些特异克隆型的T细胞与其他的CD8⁺ T_EMRA细胞大的差异分析，表明其特异性高表达细胞毒性效应基因（图4c）；为了确定其他TCR的抗原，采用GLIPH算法进行HLA分型，并在AD的2个患者中鉴定一段共有的TCRβ序列（CASSLAGGYNEQFF，称之为TCRαβ2），及另一个患者的同源序列（CASSLGTGNNEQFF，称之为TCRαβ1）（图4d），随后，对构建的TCRαβ1和TCRαβ2两个细胞系进行MHC-I肽段测试，表明TCRαβ1对肽段RAKFKQLL有反应应答（图4e、f），并通过其他实验证明此多肽抗原属于BZLF1蛋白，由HLA-B*08:01呈递（图g）。总之，研究采用的TCRαβ克隆法发现一种新的潜在的EBV BZLF1蛋白特异性的TCR克隆型。

图4 脑脊液中的CD8+细胞克隆扩张的抗原鉴定