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来自剑桥大学的研究人员采用Hi-C、Promoter Capture Hi-C、ChIP-seq、RNA-seq等多组学技术分析，发现原始态和始发态人类多能干细胞（PSCs）之间在多个空间尺度存在显著的组织特征差异，始发态细胞中的小hub因新形成的Polycomb相关互作而发生合并，形成更大的网络。在增强子活性和相互作用方面也存在广泛的特异性差异，增强子状态的变化与转录因子OCT4、SOX2和NANOG结合位点的广泛重组及其靶基因启动子的转录有关。这些发现为人类多能态在染色质的基因调控方面提供了多重见解。研究成果于2021年4月发表在Nature Communications。

文章信息

人类原始态和始发态PSCs的启动子互作、染色质状态及可视化

首先，研究人员使用Hi-C和PCHi-C方法，在同源的人类原始态PSCs和起始态PSCs细胞中得到了22,101个高分辨率的启动子互作，结果发现两种细胞中相同的互作不到一半，并且两种细胞中大多重要的互作发生在蛋白编码基因的启动子区和非启动子区之间。为了对这些互作信息进行功能性注释，研究人员整合了新的和已发表的ChIP-seq数据，使用ChromHMM软件得到基因组互作区域的染色质状态，确定活跃和稳定的启动子和增强子类、多梳结合位点和异染色质标记相关的区域。

随后，研究者使用自主开发出来的Canvas方法对两种细胞中重要的互作进行可视化，Canvas的启动子互作网络图提供了多个空间水平的基因组结构信息，数据探索范围可以从高级染色质结构到单独的启动子互作。文章中展示了细胞特异性互作的大簇，比如原始PSCs细胞中的组蛋白H1基因和始发态PSCs中的原钙黏基因。这种基因组的系统级可视化，揭示了多功能细胞中作为突出特征的大量启动子互作。

图1 Canvas方法的启动子互作网络图

长距离的启动子互作可以区分两种多能性状态

为了研究人类多能性状态的空间调控，研究人员检测了原始态和始发态PSCs中启动子互作子网络之间的差异，发现原始态PSCs中小一些的群落通过合并形成始发态PSCs中大一些的子网络。分析变化最大的子网络以及全部的启动子互作，同时结合PCHi-C数据以及经过HiCCUPS分析后的Hi-C数据，明确了长距离互作是始发态PSCs的主要特征，并且将原始态PSCs中的小群落连成大一些的子网络。因此长距离互作可以区分两种状态的细胞。

图2 始发态PSCs中的长距离启动子互作驱动多能态之间的基因组构象变化

人类始发态PSCs中的多梳相关互作网络

为进一步研究长距离启动子互作的性质，研究人员就两种状态细胞中个别HindIII酶切片段的染色质状态展开研究，发现从原始态PSCs过渡到始发态PSCs，二价染色质区域（H3K27me3和H3K4me1/3）由极少转多，证实始发态PSCs的一大标志是H3K27me3。同时，Canvas可视化所有二价和多梳相关互作网络的结果显示，该过渡后扩展的区域与发育相关（比如 DLX、 GATA 和 HOX 因子），并且主要发育基因家族的蛋白编码基因在始发态PSCs的H3K27me3相关空间互作网络中。

这个大基因集高度富集了转录调节因子和包含homeobox的因子。 例如，始发态PSCs中第7号染色体上包含SHH，EN2和MNX1的区域通过与邻近H3K27me3 peak的区域远距离互作形成了高度相互作用的簇。

图3 长距离启动子互作与始发态PSCs中的二价染色质相关

多能性状态特异性的增强子活性和互作

为了解多能态细胞之间基因调控差异，研究者注释原始PSCs和始发PSCs中的增强子，并结合PCHi-C数据识别靶基因启动子。基于排序的超级增强子（ranking of super enhancer，ROSE）流程（http://younglab.wi.mit.edu/super_enhancer_code.html）和分析结果，研究者发现超级增强子（SE）接触的大部分是细胞特异性基因的启动子，SE活性和相互作用性在两种状态的细胞中发生了实质性变化。随后的启动子-增强子互作检测以及Canvas网络可视化中，研究者在原始PSCs和始发PSCs中找到近1000个和SE有相互作用的基因存在差异，证实了大部分SE-靶基因互作是有细胞特异性的。

图4 人类多能态之间增强子活性和相互作用差异

原始特异性增强子的活性解除与DNA甲基化有关

已知的特异性增强子在不同细胞中活性不同，那么人类多能性状态改变时，增强子的变化位点发生了什么呢？

研究者对原始态特异性的增强子在始发态PSCs中解除活性的过程进行了深入研究，发现大多数发生变化的位点出现了甲基化水平上升，并且全基因组水平也出现了相似变化。在始发态PSCs中有一段75个增强子所在的区域发生有H3K27me3，并且该区域和发育基因有关。因此，大多数原始特异性增强子很可能会因获得DNA甲基化而解除活性。

图5  原始特异性增强子可能因DNA甲基化解除活性

OCT4、 SOX2和NANOG在人类多能性状态转换过程中结合位点的广泛重组

为更进一步了解人类多能性状态之间增强子的动态调控，研究者整合了ChIP-seq数据，分析在DPPA5启动子互作区域有细胞特异性结合位点的共有多能因子- OCT4, SOX2和NANOG (OSN)，结果显示OSN轨迹在两种细胞中都和活跃的增强子有显著重叠。

考虑到不同细胞类型中OSN结合不同的活性增强子，研究者推测OSN可能受细胞特异性因子招募。转录因子TFAP2C在原始态PSCs的OSN结合区域显著富集，并且没有预先结合在始发态PSCs中后来成为OSN轨迹的区域。综上推测，有一个包含TFAP2C的转录因子组合可能有助于招募OSN到活跃增强子，表明人类多能态转换过程中增强子活性、相互作用和OSN结合位点存在广泛重组。

图6 人类多能态转换之间OCT4，SOX2和NANOG在增强子结合位点的广泛重组